流式细胞术可以同时检测单个细胞的多个参数，已经广泛应用于细胞群的表征和蛋白质标记物的表达分析。在流式实验操作的过程中，我们总结了以下注意要点，帮助您得到准确、可靠的实验结果。

1. 流式分析的目标是活细胞，所以细胞活性要好。

2. 染细胞死活染料，可以减少非特异性染色，提高分辨率，所以去除死细胞的干扰非常重要。

上一组：仅基于FSC和SSC圈门来分析CD4和IFN-gamma的表达情况。

下一组: 先用Ghost Dye™ Violet 510（Tonbo Cat No. 13-0870）去除死细胞，然后再分析CD4和IFN-gamma的表达情况。

3. 调整细胞浓度，不低于1x10⁶ cells/mL，细胞量少可能会导致结果不准确或测不出来。

4. 如果想得到完整的，准确的，有说服力的结果，对照的设置是必不可少的。

（1）未染对照：即未进行标记的细胞，可以确定染色背景或自发荧光，用于调节仪器的电压。

（2）单染对照：多色染色分析时，用于荧光光谱重叠的补偿调节。

（3）同型对照：同型对照用于排除流式实验的背景信号。选择同型要符合以下三个标准：和抗体同来源；和抗体同荧光；和抗体使用一样的浓度。

用APC Anti-Mouse CD4 (Tonbo Cat No. 20-0041)标记C57Bl/6小鼠的脾脏细胞，然后用0.125 ug PE Anti-Mouse Foxp3 (Tonbo Cat No. 50-5773) (右图) 和同型对照抗体0.125 ug PE Mouse IgG1 isotype control(Tonbo Cat No. 50-4714) (左图)核内染色。

（4）FMO对照：对某个抗体设定FMO对照，除目的抗体之外，其他抗体都加上。这种对照能更好的排除染色背景，有助于画门，区分阳性细胞群。

（5）生物学对照：根据实验目的设置的阳性对照，阴性对照等。

5. FcR封闭：FcR能够与抗体的Fc段结合，在检测时产生假阳性。使用FcR封闭剂可以消除假阳性，降低检测背景，获得更清晰的结果。以下细胞类型高表达FcR，易出现高背景：人的骨髓细胞、粒细胞和B细胞，小鼠的B细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK 细胞和中性粒细胞。

6. 抗体最终使用浓度需要滴定，以确定一个适合的浓度。抗体浓度过高，容易出现非特异性结合，产生假阳性结果。

7. 抗体2-8℃原液保存，避免冻融。

8. 染色过程注意避光，保证荧光的稳定性。

9. 洗涤要充分，避免出现非特异性结合，产生假阳性或假阴性结果。

10. 使用水平转轴离心机，注意离心速度，离心后细胞沉淀要打散，避免细胞聚集。

11. 多色染色，加样注意更换枪头。

12. 注意染色顺序，先染表面抗体，再固定破膜，最后染胞内或核内抗体。

13. 胞内或核内染色时，需要保持细胞的通透性，保证抗体能进入胞内或核内与抗原结合。

14. 过滤，去除组织块或粘连的细胞团。

15. 染完后尽快上机。